Johannes Reuchlin wurde am 29. Januar 1455 als Sohn eines Klosterverwalters in Pforzheim, der damaligen Residenz der Markgrafen von Baden, geboren. Nach dem Besuch der Lateinschule seiner Heimatstadt begann er 1470 sein Studium an der Universität Freiburg. 1473 begleitete er als Erzieher einen der Söhne des badischen Markgrafen zum Studium nach Paris.

Ein Jahr später ließ er sich an der Universität Basel einschreiben, wo er sein Studium der Freien Künste 1477 mit dem Magister artium abschloss. Hier in Basel entstand mit dem lateinischen Wörterbuch "Vocabularius breviloquus" auch Reuchlins erstes Werk. An den Universitäten Orléans und Poitiers studierte er von 1478 bis 1481 die kaiserlichen Rechte. Nach dem juristischen Lizentiat kehrte er Ende 1481 nach Deutschland zurück, um in Tübingen den Dr. legum zu erwerben, was Ende 1483 bzw. Anfang 1484 auch gelang.

Inzwischen war Reuchlin als Rat in die Dienste von Graf Eberhard von Württemberg getreten. Mehrfach wurden ihm wichtige diplomatische Missionen übertragen: So nahm er 1486 am Reichstag in Frankfurt teil, 1492 war er am Kaiserhof in Linz, wo er durch Kaiser Friedrich III. in den Adelsstand erhoben wurde. Nach dem Tod Eberhards im Bart verließ Reuchlin 1496 Württemberg, weil er Nachstellungen durch einen Günstling des neuen Herrschers befürchtete.

Er fand gastliche Aufnahme in Heidelberg, wo sich ein Kreis von Humanisten um den Wormser Bischof und pfälzischen Kanzler Johannes von Dalberg versammelt hatte. Nachdem Reuchlin bereits in früheren Jahren kleinere lateinische Gedichte geschrieben hatte, entstanden hier die beiden Komödien "Sergius" und "Henno", die den Anfang des humanistischen Schuldramas markieren. 1499 konnte Reuchlin, da der neue Herrscher von den Landständen zum Rücktritt gezwungen worden war, nach Württemberg zurückkehren.

Als Nachfolger seines ehemaligen Förderers Johannes Naukler übernahm er 1502 das Amt eines Richters des Schwäbischen Bundes, das er bis zum Austritt Württembergs aus dem Bund 1513 innehatte. Kriegerische Auseinandersetzungen Württembergs mit dem Schwäbischen Bund zwangen Reuchlin in bereits fortgeschrittenem Alter zum Verlassen des Landes. Im Februar 1520 übernahm er eine Professur für Griechisch und Hebräisch an der Universität Ingolstadt, kehrte aber bereits Mitte 1521 in seine Heimat zurück, wo er noch ein Jahr an der Universität Tübingen lehrte.

Johannes Reuchlin starb am 30.06.1522 in Stuttgart.

Der Nachwelt im Gedächtnis geblieben ist aber vor allem Reuchlins Einsatz für den Erhalt der jüdischen Literatur. Im Jahre 1509 hatte der zum christlichen Glauben konvertierte Johannes Pfefferkorn von Kaiser Maximilian ein Privileg zur Beschlagnahme jüdischer Bücher erhalten. Wenn man den Juden ihre Literatur wegnähme, so glaubte Pfefferkorn, würden diese nicht mehr in ihrem Glauben verharren, sondern zum Christentum übertreten.

Auf Anordnung des Mainzer Erzbischofs musste Pfefferkorn die bereits begonnene Aktion jedoch abbrechen. Kaiser Maximilian beauftragte daraufhin die theologischen Fakultäten mehrerer Universitäten sowie einzelne Theologen mit Gutachten zu der Frage, wie mit den jüdischen Büchern verfahren werden solle. Auch Reuchlin wurde um ein Gutachten gebeten und sprach sich als einziger gegen eine Beschlagnahme und Vernichtung aus.

Er berief sich dabei auf den Schutz des Eigentums, der auch für die Juden als "Mitbürger" des Reiches gelte. Die jüdische Literatur betrachtete er als Zeugnis für die Wahrheit des Christentums und damit auch als Mittel zur Mission an den Juden. Wegen seiner Haltung kam es zum Streit mit Pfefferkorn und der hinter diesem stehenden theologischen Fakultät der Universität Köln.

Die Fakultät verurteilte den "Augenspiegel", eine Schrift, in der Reuchlin seine Position erläutert und sich zugleich gegen Vorwürfe Pfefferkorns zur Wehr gesetzt hatte, als unzulässige Begünstigung des jüdischen Irrglaubens. Andere theologische Fakultäten schlossen sich dem Urteil der Kölner an. Reuchlin dagegen wurde breite Unterstützung von seiten seiner humanistischen Freunde zuteil, die den Streit zu einer Generalabrechnung mit der in ihren Augen verknöcherten Scholastik umgestalteten.

Den Höhepunkt in dem von beiden Seiten mit aller Schärfe ausgetragenen literarischen Streit bildeten die von Crotus Rubeanus und Ulrich von Hutten verfassten "Dunkelmännerbriefe". Die ursprüngliche Frage des Erhalts der jüdischen Literatur rückte dabei vollkommen in den Hintergrund, und Reuchlin nutzte die Unterstützung durch die humanistischen Freunde wenig. Zwar erklärte 1514 der von Papst Leo X. mit der Entscheidung des Falles beauftragte Speyerer Bischof, Reuchlins "Augenspiegel" enthalte keine Irrtümer und Ketzereien und begünstige auch die Juden nicht in ungebührlicher Weise.

1520 wurde die Schrift jedoch unter dem Eindruck des Prozesses gegen Luther verboten und Reuchlin ewiges Stillschweigen auferlegt.